浅谈流式细胞仪十大发展趋势

从二十世纪八十年代至今，世界上生产流式细胞仪的厂家几经变迁，BC & BD仍在，新玩家不断进入，并购重组各取所需，它们生产各种不同性能和功能的流式细胞仪。总体而言，呈现出以下的发展趋势：

　　1. 应用对象从细胞到颗粒

　　一般而言，流式细胞仪检测的对象是细胞，而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，即单细胞悬液。组织和器官中的细胞，bi须用各种方法制备成单细胞悬液，才能进行检测。

　　细菌、浮游生物等也可以用流式细胞仪分析。

　　一些不是细胞的单个粒子，如病毒、细胞核、染色体、原生质体等也是流式细胞仪的检测对象。实际上，用“颗粒”而不仅仅是“细胞”来定义流式细胞仪的检测对象，显然更有代表意义。

　　因为流式细胞仪可以将“颗粒”视同为“细胞”来进行检测，在te制的微球上包被抗原，抗体或核酸探针，以微球为载体来检测各种可溶性蛋白、细胞因子、自身抗体、特定的核酸序列等，从而使流式细胞仪的检测对象扩展到分子范围。

　　Luminex公司的多重流式检测平台能够自一个微量反应孔中同时检测50、100甚至多达500种分析物，俨然成为这一技术的金标准。

　　2. 检测颗粒尺度大大拓宽

　　常规流式细胞仪检测颗粒的范围为0.5-50μm。

　　电荷分选流式细胞仪检测颗粒范围与喷嘴直径等相关，zui大应到喷嘴直径的1/3-1/2，目前zui大直径的喷嘴为200μm。

　　Union Biometrica公司的气流分选平台COPAS FP和BioSorter能够适应大到1500μm的颗粒，可以用于分选模式动物的卵和幼虫;模式植物种子与花粉;大体积细胞与细胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm。　　

Union Biometrica公司气流分选流式原理图

　　通过光路优化，采用多角度光散射，使用特殊荧光探针，甚至加装紫色激光收集散射光信号，有些流式细胞仪可以实现0.2μm颗粒与噪音信号的鉴别。

　　Apogee着力于微颗粒分析，其A50-Micro plus散射光的检测低限至80nm，可用于循环微粒，外泌体及特殊微生物检测。

02.jpg

Apogee A50-Micro plus

　　3.多种流路技术商品化

　　绝大多数流式细胞仪基于鞘液流体动力学模式。

　　因为负压进样省去了庞大的压缩气源，可以灵活使用各种上样管，已经成为几乎所有公司新仪器的选择。

　　一般认为，流式细胞仪采用毛细管而非鞘液，容易被大的细胞或聚集细胞所阻塞，而且流动细胞难以准确聚焦，流速难以维持恒定。

　　Guava平台easyCyte(现被Luminex公司收购)通过负压进样，采用高压注射泵与PEEK管路，建立自稳流的微毛细管系统，据称解决了以上困扰，带来的好处是无需鞘液，产生废液也少。

Guava easyCyte(Luminex)

　　Thermo公司声波流式细胞仪Attune NxT ，该产品利用chao声波将细胞聚集在样品流中轴线上。进样速度至1mL/min时，也可以避免基于鞘液的流式的所谓轴流加宽和细胞分散现象，这一技术的zui大优势是快速检测，同时对xi有细胞的分析比较有利。

Thermo Attune NxT

　　4.从相对计数到直接jue对计数

　　为满足统计学要求，流式细胞仪必须采集一定数量的细胞，仪器设定以细胞数为停止条件。传统流式细胞仪测试结果为相对计数，即目标细胞在某一总体系中的比值。

　　随着应用深入，人们发现比值的变或者不变，以及变化大小不能反映细胞的真实变化，jue对计数，即单位体积内的细胞数被证明更具实际价值。

　　zui早是采用双平台法来解决以上问题，即用血细胞分析仪来获得白细胞，淋巴细胞等浓度，再结合流式细胞仪测定的百分比来计算被测细胞的jue对计数值。由于该法需要使用两种仪器，操作步骤多、变异系数大，不同实验室之间的差异也较大，因此应用受到限制。

　　后来人们采用微球法，即用已知浓度的微球作为参比，通过被测细胞和微球的比例关系来进行jue对计数，但因计数微球价格较为昂贵，实际应用受到限制。

　　近年来，厂家的共识回到了测定进样体积这一思路上来，替代微球法直接进行jue对计数，取得更为Jin确的结果。区别在于不同产品具体测定技术的差别。

　　蠕动泵：Accuri C6 Plus、CytoFlex

　　注射泵：easyCyte、NovoCyte、CytoFlow

　　流量传感器：FACSVerse、Bricyte E6

Sysmex CytoFlow系列TVAC体积测定原理

　　5.光路优化和光学新元件的应用

　　庞大的水冷或气冷的激光器逐渐被小型化的固态激光器取代。

　　光纤传导应用越来越普遍。

　　光纤耦合让光能量传输更gao效，而不为公司所专有。

　　雪崩光电二极管等等新检测器提供新的选择。请见专家分析：

　　流式细胞仪是怎么“看见”光的?

　　以及光学元件的神级组合让灵敏度达到新的高度。

　　MESF是仪器灵敏度衡量的标准，基于微球，基于鞘液。

　　不同公司没有约定俗成，不是那么容易比较，但就同一公司产品而言：

　　BD FACSCelesta FITC 25 PE 15

　　Beckman Coulter CytoFlex FITC 30 PE 10

　　6.以多色分析为核心的新型光学技术的迅速发展

　　早期流式细胞仪的主要应用还是细胞DNA含量测定，这一技术对设备要求不高，通常配备一个散射光和一个荧光信号的流式细胞仪就足以应付。随着新型荧光探针的不断开发和仪器软、硬件的逐步更新，流式细胞仪多色荧光分析得到了迅速发展，包括两个方面：

　　单激光多色，如488nm激光同时激发7色，紫色激光同时激发10色

　　多激光：如10激光机器。

　　也包括两种新的光学设计机型：

　　光谱流式，利用特殊的接受装置收集某范围内的全发射光谱，无需补偿，区别发射光谱重合度高的荧光染料对。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800，Cytek公司的Aurora。

　　质谱流式，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。这个名为CyTOF的平台ui初由DVS Sciences公司开发，后被Fluidigm公司收购。仪器采用同位素标记抗体来标记或识别细胞表面和内部的信号分子，并根据流式细胞原理分离单个细胞，再用感应耦合等离子质谱(ICP-MS)观察单个细胞的原子质量谱，zui后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据。2015年推出的Helios的检测通道达到135个，几乎没有信号重叠或背景噪音。